雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態光源優勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡的原理是什么？進口2PPLUS雙光子顯微鏡授權供應商

新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統的成功研制是**重大科研儀器研制專項的一個碩果。它彰顯了北京大學在生物醫學成像領域先期布局的前瞻性，鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體、具有學科交叉背景和重要技術創新能力的“中國智造”隊伍。目前，該研發團隊正在領銜建設“多模態跨尺度生物醫學成像”十三五**重大科技基礎設施，積極參與即將啟動的中國腦科學計劃。可以期待，微型化雙光子熒光顯微成像系統將為實現“分析腦、理解腦、模仿腦”的戰略目標發揮不可或缺的重要作用進口2PPLUS雙光子顯微鏡授權供應商雙光子顯微鏡觀察到的現象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發的鈉離子作用電勢。

隨著技術的發展，雙光子顯微鏡的性能不斷優化。結合其特點，大致可以分為兩個方面:深入和主動改進。為了使激發激光進入更深的層次，可以從器件優化和標本改造兩個方面入手。關于器件的優化，我們可以把激光束做得更細，集中能量，讓激光穿透得更深。對于樣品，物質的吸收和散射是影響光傳播的主要因素。為了解決這個問題，我們需要將樣本透明化。一種方法是用某種物質浸泡標本，使其中的物質(主要是脂質)被破壞或溶解。另一種方法是通過電泳電解脂類，從而提高標本的“透明度”。

而配合了雙光子激發技術，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發揮**。那么，什么是雙光子激發技術呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發技術。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發生雙光子激發，產生熒光，該點產生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而達到逐點掃描的效果。雙光子顯微鏡還可以對一些具有特性的染料細胞進行實驗，還有一些短波長可以利用雙光子特性進行特定實驗。

雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發技術的一種新技術。雙光子激發的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區域；因信號背景比高，而具有更高的對比度；因激發體積小，具有定點激發的特性，具有更少的光毒性；激發波長由紫外、可見光調整為紅外激發，使其能夠更加**。雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器。國內雙光子顯微鏡ultima

雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對神經細胞的形態結構、離子濃度、細胞運動、進行直接成像監測。進口2PPLUS雙光子顯微鏡授權供應商

隨著技術的發展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優化，結合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優化與標本改造。關于裝置優化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關于標本，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質電解，讓標本的“透明度”得到提高。進口2PPLUS雙光子顯微鏡授權供應商